產(chǎn)品名稱：ALPORT綜合癥IV型膠原免疫組化染色試劑盒

生產(chǎn)廠家：EURO Diagnostic

產(chǎn)品貨號：ALP105

1 簡介

試劑盒適用于ALPORT綜合癥腎組織和皮膚組織切片的染色，有助于ALPORT綜合癥的診斷。患有ALPORT綜合癥的病人，IV型膠原的α5 鏈發(fā)生基因突變，這會導(dǎo)致IV型膠原α5 鏈在腎小球基底膜和皮膚基底膜以及IV型膠原α3 鏈在腎小球基底膜的低表達。

2 試劑盒組成及試劑保存

IV型膠原α1鏈單抗 （MAB1） 1 ml

IV型膠原α3鏈單抗 （MAB3） 1 ml

IV型膠原α5鏈單抗 （MAB5） 0.5ml

甘氨酸/尿素 稀釋液    2x23ml  (低溫保存，尿素易緩慢分解)

3 切片的染色

3.1 冰凍切片的染色

 1）冰凍組織切片（3μm），晾干，丙酮固定10min，PBS 沖洗。

 2）Mab5 染色的切片，用冷的甘氨酸/尿素 稀釋液變性，孵育5min，蒸餾水洗滌。

 3）加入MAB1、MAB3、MAB5（一般1/25-1/75PBS 稀釋）孵育1小時，PBS洗滌。

 4）加入FITC 標記的抗鼠二抗，孵育1小時。

 5）PBS洗滌，加入含有對苯二胺的封片劑，以延長熒光淬滅時間。

 3.2 石蠟切片的染色

 1）切片脫蠟至水用于染色。（3-4μm）。

 2）抗原修復(fù)-分兩種方式完成

   蛋白酶緩沖液的制備：

   25mg 蛋白酶XXIV(Sigma P8038 ) + 25mg Cacl2 + 45ml 蒸餾水+ 5ml 0.05M Tris-HCL 緩沖液 PH7.6。混勻，加熱到37℃。

  a. MAB1 和MAB3 切片置于檸檬酸鹽緩沖液中（PH2.0 ），微波爐750W 加熱8min，隨后350W 15min，（用Dako 公司的S2031檸檬酸鹽緩沖液PH6,用1M HCl 調(diào) PH到PHJ2.0）,（轉(zhuǎn)到第3步）

 b. Mab5: 切片置于檸檬酸鹽緩沖液中（PH2.0 ），微波爐750W 加熱8min，隨后350W 5min，蒸餾水漂洗2次。加0.05%蛋白酶緩蛋白酶XXIV沖液（Sigma P8038）,微波爐加熱37℃ ，5min。蒸餾水漂洗5分鐘。加甘氨酸/尿素 稀釋液（試劑盒提供）4-6℃，孵育10min. 蒸餾水漂洗2x2 min。

  3）用1.5% H₂O₂ (TBS稀釋) 封閉10min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶。自來水漂洗5min，蒸餾水漂洗1min。

  4）1：50 稀釋MAB1和MAB3，1：200稀釋MAB5，孵育25min。

用Dako 公司的Envision Flex Kit 顯色試劑盒

  5）加入Envision Flex +Mouse (SM804,Dako),25 min.

  6) 加入Envision Flex +Mouse (SM802,Dako),20 min.

  7）加入底物工作液(mix)(SM803,Dako),5min x2.

  8) 加入Envision Flex蘇木精復(fù)染（SM806,Dako）,5min.

4 說明：

為了更準確的解釋實驗結(jié)果，需在實驗時做陰性對照（不加一抗）和陽性對照（MAB1）。陽性對照是為了說明樣本的處理和染色操作的正確性。在腎小球基底膜著色較強。陰性對照用于排除一些非特異性染色。

MAB3 和MAB5 正常情況下在整個腎小球基底膜都是著色的。對于ALPORT綜合癥X染色體顯性遺傳病人來說，男性樣本不著色，女性樣本著色成不連續(xù)分布。對于常染色體陰性病人，MAB5在腎小球和集尿管基底膜囊成陽性，而MAB3成陰性。

MAB3一般在皮膚組織中成陰性，而MAB5在皮膚組織中成陽性。對于X染色體顯性遺傳病人來說，男性樣本通常成陰性，女性樣本部分著色。對于常染色體的陰性遺傳病人來講，MAB5通常在皮膚基底膜染色。

表1

¤抗5α鏈抗體著色出現(xiàn)在腎小球囊和集合管基底膜。